在实时荧光定量PCR（qPCR）技术中检测肿瘤基因突变时，“跨越”是指设计的特异性荧光探针的序列覆盖范围必须横跨（包含）疑似突变位点。这意味着探针的一部分碱基会直接覆盖在DNA序列中可能发生突变的区域（如单核苷酸点突变、插入或缺失位点），使探针与靶序列的结合稳定性对突变高度敏感。
#精选AI回答
通俗解释整个检测过程：
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探针设计（“跨越”的核心）
设计一条荧光探针（如TaqMan探针或双标记探针），其序列包含突变位点所在的区域。例如：- 若某肿瘤基因的第100位碱基可能从“A”突变为“T”，探针将设计为覆盖第98~102位碱基（突变点位于探针中央）。
- 若靶序列无突变（野生型），探针与DNA完全匹配，结合牢固；
- 若靶序列有突变，探针结合时因碱基错配而“松动”。
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PCR扩增与荧光释放
- 在PCR反应中，探针结合到目标DNA上（结合强度取决于突变与否）。
- 当DNA聚合酶复制到探针位置时，会切断探针，释放荧光信号（原理见图）。
- 无突变：探针结合紧密，需较高温度才能解开（熔解温度Tm高）；
- 有突变：碱基错配导致结合不稳，较低温度即可解开（Tm低）。
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熔解曲线分析（判断突变的关键）
- 扩增完成后，仪器缓慢升温（如从60℃升到95℃），实时监测荧光信号衰减。
- 野生型DNA：探针结合稳定，荧光在高温（如75℃）才突然下降；
- 突变型DNA：探针结合弱，荧光在较低温（如68℃）就快速衰减。
- 通过比较熔解曲线的“波谷”位置（Tm值差异），即可判断突变是否存在。
在肿瘤诊断中的实际意义
- 精准识别突变：例如检测肺癌的EGFR基因突变（如T790M），可指导靶向药选择。
- 高灵敏度：即使样本中仅有少量肿瘤DNA（如血液中的循环肿瘤DNA），也能检出突变。
- 快速经济：无需基因测序，2–4小时内完成检测，适用于临床筛查。
💎 简单类比：把探针想象成一把“钥匙”，突变位点相当于锁芯的一个凹槽。
- 钥匙完全匹配锁（无突变）→ 插得紧，用力扭才能打开（高Tm）；
- 钥匙齿形有偏差（突变）→ 插不牢，轻轻扭就松开（低Tm）。
熔解曲线就是测试“钥匙在不同力度下是否脱落”的过程。
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